Каталог продуктов для клинической лабораторной диагностики
Молекулярная диагностика
Молекулярная диагностика »
Диагностика наследственных болезней
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА
Диагностика наследственных болезней
Точечные мутации, т. е. замены одного нуклеотида, являются причиной генных болезней (моногенных болезней), которые способны передаваться из поколения в поколение в соответствии с законами Менделя. К настоящему моменту описано около 4000 заболеваний, которые являются причиной детской смертности в возрастной группе до 5 лет в 8-10% случаев.
Кроме того, наличие таких мутаций вкупе с факторами внешней среды может обуславливать развитие болезней с наследственной предрасположенностью (мультифакториальных). Их диагностика осложняется размытыми симптомами, разной степенью проявления в зависимости от пола, возраста и степени влияния фактора(ов) среды.
Показано наличие наследственной предрасположенности к некоторым видам рака, сердечно-сосудистым и неврологическим заболеваниям и т. п. Так, например, риск венозной тромбоэмболии в ходе беременности возрастает в 8 раз при наличии мутаций в генах, кодирующих фактор свёртываемости крови V , протромбин или 5,10-метилентетрагидрофолат редуктазу ( MTHFR ) и существенно выше (в 10-20 раз), когда мутации присутствуют одновременно в двух факторах. У 50-65% женщин с привычной невынашиваемостью беременности обнаруживаются наследуемые формы коагулопатий, в 17% случаев преэклампсия вызвана наличием мутантной формы фактора V .
Ранняя диагностика позволяет правильно определить клинический или жизненный прогноз с выработкой некоторых рекомендаций, например, выбор диеты или терапии. Кроме того, современные методы позволяют осуществлять пренатальную или преимплантационную диагностику или скрининг носительства.
Для детектирования точечных мутаций при тестировании на генные и мультифакториальные болезни мы предлагаем наборы производства Pronto Diagnostics (Израиль). Реагенты, входящие в стандартный набор, обеспечивают:
- предварительную амплификацию фрагмента ДНК, предположительно несущего нуклеотидную замену, методом полимеразной цепной реакции (ПЦР);
- сайт-специфичную элонгацию олигонуклеотидного зонда;
- детекцию результатов в микропланшете.
Технология «Пронто»
Амплифицируют ДНК (50-300 нг/мкл) с использованием праймеров, ограничивающих полиморфный по одному нуклеотиду локус (ДНК-полимераза в комплект не входит).
Непрореагировавшие нуклеотиды инактивируются.
При детекции одной мутации раствор, содержащий ампликоны, вносят в две соседние лунки ПЦР-планшета. В лунках содержатся:
- 5’- FITC -меченый зонд, комплементарный последовательности ДНК, примыкающей к тестируемому нуклеотиду,
- и единственный биотинилированный нуклеотид, комплементарный либо мутантному аллелю либо аллелю дикого типа. Соответствующие лунки маркированы цветом.
Планшет помещают в термоциклер и проводят несколько циклов присоединения биотинилированного нуклеотида к 3’-концу зонда. Элонгация и, соответственно, включение биотина происходит в том случае, если биотинилированный нуклеотид комплементарен тестируемому нуклеотиду в ампликоне.
Реакционную смесь разбавляют и переносят в лунки микропланшета, к стенкам которых пришит стрептавидин. После инкубации несвязавшийся зонд (не биотинилированный на предыдущей стадии) отмывают и добавляют в лунки конъюгат пероксидазы хрена с антителами к FITC . При добавлении хромогенного субстрата развивается окраска.
Результат оценивают визуально, фотографируют или получают изображение при помощи видеосистемы, либо анализируют на микропланшетном фотометре с использованием стандартной процедуры cut - off .
|
Этап анализа, «Пронто» |
Затраченное время |
|
Пробоподготовка Dynal /«стандартная» |
20 мин/~1 час |
|
ПЦР |
1,5 часа |
|
ПостПЦР-обработка |
40 мин |
|
Элонгация зонда |
20 мин |
|
Детектирование |
30 мин |
Преимущества методологии Пронто:
- стандартизация – для анализа мутаций во всех наборах используется одна и та же процедура в одном и том же микропланшетном формате;
- возможно одновременное определение нескольких мутаций;
- анализ осуществляется не по опосредованным маркёрам, а непосредственно по первичной последовательности геномной ДНК;
- результат демонстрирует гомо- или гетерозиготность по определяемой мутации, а не только её наличие;
- детектирование происходит аналогично широко распространённой процедуре иммуноферментного анализа, без проведения электрофореза;
- маркируется в ЕС «для диагностики in vitro .
- продолжительность анализа – в пределах 5 часов.
Справочник составлен специалистами ЗАО - "БиоХимМак".
|
